來源 | 中外葡萄與葡萄酒
摘 要: 葡萄霜霉病是嚴(yán)重危害葡萄的世界性病害，抗霜霉病育種是解決歐洲葡萄抗病性差的有效途徑。 中國蘊(yùn)藏著豐富的野生葡萄種質(zhì)資源，鑒定這些資源的抗病性是抗病育種的前提。本文采用田間自然鑒定法，對中國野生葡萄10個種29個株系以及17個歐洲葡萄品種、9個歐美雜交品種共55份材料進(jìn)行抗霜霉病鑒 定，研究不同種質(zhì)資源的抗病性;進(jìn)一步在人工接種霜霉菌后，對抗病毛葡萄株系丹鳳-2及感病品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍(lán)’進(jìn)行霜霉菌的侵染過程觀察，比較抗病與感病材料中菌絲生長差異;在人工接種 霜霉菌條件下，對中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾和感病品種‘黑比諾’‘白玉霓’的抗病相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明:中國野生葡萄、歐洲葡萄、美洲葡萄對霜霉病表現(xiàn)出抗病性差異，其中中國野生葡萄商南-1、湖南-1、商南-2、南鄭-1、白水-40、渭南-3、安林-2、安林-3以及歐美雜種‘瑞比爾’‘高妻’ 與砧木材料‘SO4’對霜霉病有較高的抗性，這些材料具有強(qiáng)的抗霜霉菌入侵能力，以及抗病相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)。因此，本研究中中國野生葡萄中對霜霉病表現(xiàn)抗病的株系是今后抗病育種可以利用的親本材料。
葡萄是一種廣泛栽培的果樹，在世界和我國園藝作物中都有很高的經(jīng)濟(jì)價值。據(jù)世界糧農(nóng)組織(FAO) 數(shù)據(jù)顯示，2019年全球葡萄栽培面積達(dá)到692.6萬 hm2， 總產(chǎn)量達(dá)到7713.9萬 t。其中，我國葡萄面積74.6萬hm2， 居世界第二位;葡萄產(chǎn)量達(dá)1437.2萬 t，居世界第一位。 葡萄生產(chǎn)中的主栽品種以歐洲葡萄為主，品質(zhì)好，風(fēng)味佳，用途廣泛，但易感霜霉菌、白粉菌等真菌病害。 病害發(fā)生時，以化學(xué)方法噴藥為主，這不僅增加生產(chǎn)成本、造成環(huán)境污染，還會導(dǎo)致殺菌劑殘留，降低葡萄品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。從長遠(yuǎn)看，進(jìn)行抗性育種是解決歐洲葡萄品種抗病性差的有效途徑。葡萄抗病育種的前提是擁有抗病的種質(zhì)資源，中國作為葡萄屬植物的重要起源中心之一，擁有豐富的野生葡萄種質(zhì)資源，對霜霉病表現(xiàn)出極好的抗性。因此，對包括中國野生葡萄在內(nèi)的種質(zhì)資源進(jìn)行抗霜霉病的田間自然鑒定，篩選抗病種質(zhì)資源，對于抗霜霉病育種具有重要的科學(xué)意義。霜霉病是葡萄最具破壞性的真菌病害之一，是由一 種來自北美野生葡萄上的霜霉菌(Plasmopara viticola) 引起，后來通過砧木、接穗等途徑在歐洲各主產(chǎn)區(qū)傳播爆發(fā)，對歐洲葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失。我國由于早期缺乏相應(yīng)的檢驗檢疫措施導(dǎo)致霜霉病進(jìn)入并大規(guī)模發(fā)病。葡萄霜霉菌主要侵染葉片，在環(huán)境條件適宜時，病菌在一個生長季內(nèi)連續(xù)繁殖多代，導(dǎo)致病情呈暴發(fā)式發(fā)展，使樹體光合性能降低，光合產(chǎn)物合成受阻， 從而影響葡萄產(chǎn)量和果實品質(zhì)。在田間自然條件下，根據(jù)發(fā)病率調(diào)查葡萄種質(zhì)資源發(fā)病情況。按照感病指數(shù)統(tǒng)計，將葡萄種質(zhì)與株系的抗病性分成5級。對中國野生葡萄10個種29個株系以及17 個歐洲品種、9個歐美雜種進(jìn)行霜霉病抗病性鑒定，篩選抗霜霉病的種質(zhì)資源。同時，采用苯胺藍(lán)染色法，結(jié)合熒光顯微鏡技術(shù)對霜霉菌在抗病株系和感病品種中的侵染過程進(jìn)行觀察，并利用實時熒光定量PCR檢測技術(shù)對葡萄霜霉菌抗病相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，進(jìn)一步證實葡萄種質(zhì)資源的抗病表現(xiàn)，以期為葡萄抗霜霉病育種提供依據(jù)。
一、材料與方法
1.1 試驗材料
2019—2020年在霜霉病流行后期的9月進(jìn)行調(diào)查。田間自然抗病鑒定材料為中國野生葡萄10個種29個株系以及17個歐洲品種、9個美洲品種共計55份。田間試驗于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃進(jìn)行，室內(nèi)分析研究在國家旱區(qū)作物逆境生物學(xué)實驗室與農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝 作物生物與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室進(jìn)行。
1.2 葡萄霜霉病田間抗病性鑒定
按照葉片感病面積占整個葉片面積的百分比，將葡萄抗霜霉病分為0~7共8個級別進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計，然后用加權(quán)的方法統(tǒng)計出植株發(fā)病的感病指數(shù)。計算公式如下:感病指數(shù)=Σ(病極值×該級發(fā)病葉數(shù))/(調(diào)查總?cè)~數(shù) ×最高病極值)×100%根據(jù)感病的嚴(yán)重程度把材料分成5級。具體是:0 為免疫或未發(fā)病;0.1~5.0為高抗;5.1~25.0為抗病; 25.1~50.0為感病;50.1~100為高感。
1.3 葡萄葉片苯胺藍(lán)染色過程
苯胺藍(lán)染色液制備方法參考李卓方法。取0.05 g苯 胺藍(lán)溶于100 mL磷酸二氫鉀(0.067 Mol)中制備0.05%苯胺藍(lán)染色液。將霜霉菌孢子囊懸浮液(2 ×104 cfu/mL) 均勻噴灑在葡萄葉背并套袋。分別于接種后0、12、36、60、84 h取樣浸泡于0.05%苯胺藍(lán)染色液中過夜。將葉背面朝上放在載玻片上，用藍(lán)紫光觀察菌絲生長情況。
1.4 熒光定量PCR分析抗病基因的表達(dá)
實時熒光定量PCR的引物設(shè)計參照Cheng等列于 (表1)，對‘丹鳳-2’‘塘尾’‘白玉霓’‘黑比諾’ 人工接種霜霉菌處理，于接種后0、12、24、48、72、96 h分別采樣提取RNA。提取方法參照Hipure Plant RNA Mini Kit試劑盒(Magen R4151-02)的說明書。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法參照SumOnetube RT Mixture III(gDNA removal)試劑盒(夏末科技 SUM7806)的說明書。稀釋后的cDNA作為qRT-PCR的模板。以葡萄Actin為內(nèi)參 基因。實驗方法參考Shi進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，每處理 3次技術(shù)重復(fù)。
1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
用Excel軟件對大田統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，用 Origin 8.0繪制實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析圖。基因相對表達(dá)量的顯著性分析通過SPSS 25.0單因素方差分析的LSD法分析比較檢驗(P<0.01)差異結(jié)果。
二、結(jié)果與分析
2.1 葡萄霜霉病田間自然抗病性鑒定
2.1.1 中國野生葡萄霜霉病田間自然抗病性鑒定
利用田間自然抗病鑒定的方法對中國野生葡萄10個種29個株系進(jìn)行抗霜霉病鑒定(表2)。其中，中國野生種華東葡萄商南-1、湖南-1、商南-2，毛葡萄南鄭-1，復(fù) 葉葡萄眉縣-6、白水-40、渭南-3，癭薁葡萄安林-2、安林-3對霜霉病有較高的抗性;復(fù)葉葡萄留壩-11、留壩-9 為易感霜霉病株系。
2.1.2 歐洲種與歐美雜種葡萄霜霉病田間抗病性鑒定
利用田間自然抗病鑒定方法對17個歐洲種、9個歐美雜種進(jìn)行抗霜霉病鑒定。其中歐美雜種‘瑞比爾’‘SO4’‘高妻’對霜霉病有較高的抗性;歐洲品種 ‘白詩南’‘法國藍(lán)’‘黑玫瑰’易感霜霉病(表3)。
2.2 田間人工接種霜霉菌的侵染菌絲觀察
利用人工接種的方法對抗病株系丹鳳-2，感病品種 ‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍(lán)’進(jìn)行人工接種霜霉菌處理，觀察侵染過程。發(fā)現(xiàn)丹鳳-2接種霜霉菌84h后可觀察到初生菌絲;‘白玉霓’接種12h后有初生菌絲，36h后有分支的長菌絲，84h后出現(xiàn)聚集成團(tuán)的長菌絲; ‘黑比諾’接種12h后可觀察到長菌絲，36h后可觀察 到有分支的長菌絲，60h后出現(xiàn)聚集成團(tuán)的長菌絲，84h 后出現(xiàn)壞死;‘法國藍(lán)’接種12h后可觀察到長菌絲，36h后可觀察到有分支的長菌絲，84h后出現(xiàn)聚集成團(tuán)的長菌絲。霜霉菌侵入‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍(lán)’ 后，菌絲的生長和發(fā)育明顯快于丹鳳-2。
2.3 部分種質(zhì)抗病相關(guān)基因表達(dá)水平
通過病原菌侵染觀察，對不同種質(zhì)的入侵能力不同，這可能與組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，也可能與抗病基因表達(dá)后促進(jìn)抵抗病原菌入侵的物質(zhì)累積有關(guān)。對兩個中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾和兩個易感品種‘黑比諾’‘白玉霓’接種霜霉菌后進(jìn)行qRT-PCR分析，通過檢測抗病相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果顯示，抗病基因在抗病品種和易感品種中的表達(dá)有顯著差異，中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2的葉片接種霜霉菌12h后苯丙氨酸解氨酶基因 PAL表達(dá)量顯著提高，芪合酶基因STS接種霜霉菌96h后表達(dá)量顯著高于易感品種‘黑比諾’‘白玉霓’;中國 野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾的葉片接種霜霉菌后病程 相關(guān)基因非表達(dá)子NPR1基因均出現(xiàn)表達(dá)量遞減的情況;中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾和兩個易病品種‘黑 比諾’‘白玉霓’的葉片在人工接種霜霉菌后，類甜蛋 白基因TLP 均出現(xiàn)表達(dá)量遞增的趨勢。
三、討論與結(jié)論
中國蘊(yùn)藏著豐富的野生葡萄種質(zhì)資源，鑒定這些資源的抗病性是抗病育種的前提。賀普超等提出中國野生葡萄抗霜霉病的鑒定方法并對中國野生葡萄21個種 67個株系和部分歐洲品種進(jìn)行抗病性鑒定認(rèn)為，華東葡萄、燕山葡萄、瘤枝葡萄、復(fù)葉葡萄、秋葡萄對抗霜霉病具有良好的抗性。本次田間自然抗病性鑒定也發(fā)現(xiàn)，中國野生葡萄華東葡萄商南-1、湖南-1、商南-2， 復(fù)葉葡萄眉縣-6、白水-40，秋葡萄白河-22、平利-7等株系對霜霉病都有較高的抗性。Blaich利用人工接種方法對45個歐洲種、32個美洲種及26個歐美雜交子代進(jìn)行接種霜霉菌處理，發(fā)現(xiàn)接種后歐洲種最容易表現(xiàn)癥狀，其次為歐美雜交子代，最不容易出現(xiàn)癥狀的為美洲種。 Bower以歐洲種為試材，利用田間自然抗病性鑒定法對29個歐洲種進(jìn)行鑒定后認(rèn)為，不同品種對霜霉病的抗 性也不同。Burruano利用人工接種霜霉菌的方法對不 同葡萄品種接種后發(fā)現(xiàn)，霜霉菌在不同品種中的生長速度不同，其中霜霉菌在歐洲品種中生長最快。本試驗田間自然抗病性鑒定也發(fā)現(xiàn)，中國野生種、歐美雜交子代對霜霉病的抗性普遍高于歐洲品種。利用苯胺藍(lán)染色的方法發(fā)現(xiàn)霜霉菌侵入感病的歐洲品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍(lán)’后，其菌絲的生長和發(fā)育明顯快于侵入中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2;Trouvelot以18個歐洲種、11個美洲種為試材，人工接種霜霉菌的侵染過程發(fā)現(xiàn)，在接種霜霉菌5d后，18個歐洲種中有17個出現(xiàn)壞死性病斑，而11個美洲種均沒有出現(xiàn)壞死性病斑，這與本試驗結(jié)果類似。萬怡震等對中國野生葡萄17個種的 67個株系在自然條件下進(jìn)行抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)多個株系對霜霉病抗性鑒定結(jié)果與本鑒定結(jié)果存在一定的差異， 這可能與年份、樹齡及病原菌積累有關(guān)，這為進(jìn)一步的研究提供了方向。Javier以21個美洲品種和60個歐洲品種為試材，利用離體接種鑒定的方法進(jìn)行霜霉病抗性評價后認(rèn)為，歐洲種對霜霉病的抗性普遍低于美洲種。 Toffolatti以美洲種、歐洲種以及歐美雜種為試材，人工接種霜霉菌后從組織結(jié)構(gòu)抗性和生理生化抗性進(jìn)行分析后認(rèn)為，美洲葡萄對霜霉菌較高的抗性與葉片結(jié)構(gòu)和抗病基因的表達(dá)有關(guān)。組織結(jié)構(gòu)是植物抵抗真菌病害的重要器官。在棉花、蠶豆、棗樹等植物中都發(fā)現(xiàn)物理防御機(jī)制是植物抵御真菌侵染的重要方式。早期Marois以‘無核白’為試材利用氯仿溶劑除去葡萄表皮蠟質(zhì)層后發(fā)現(xiàn)，‘無核白’ 對灰霉病的抗性顯著降低;Selim以‘無核白’和‘雷司令’為試材利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析后認(rèn)為，葡萄葉片下表皮中的殼聚糖合成基因是響應(yīng)霜霉菌侵染的 重要基因。Lemai?tre-Guillier通過葡萄蛋白質(zhì)組學(xué)分析認(rèn)為，角質(zhì)層是葡萄抵御霜霉菌侵染的重要屏障。有學(xué)者采用轉(zhuǎn)錄和代謝組學(xué)分析認(rèn)為，葡萄上表皮中的殼聚糖是抵御葡萄灰霉菌的重要物質(zhì);韓蕊通過對不同抗性葡萄葉片與黑痘菌互作的超微結(jié)構(gòu)觀察認(rèn)為，葡萄對黑痘病的抗性與上表皮厚度有關(guān)。林玲認(rèn)為，毛葡萄葉背絨毛為阻礙霜霉菌的侵染發(fā)揮了重要作用。本次通過對人工接菌后的中國野生毛葡萄抗病株系丹鳳-2，感病品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍(lán)’侵染過程的觀察，認(rèn)為丹鳳-2葉背絨毛是其抵抗霜霉菌侵染的屏障。葡萄生理生化指標(biāo)抗性是其抵御真菌侵染的重要途徑。苯丙氨酸解氨酶基因PAL表達(dá)量和活性的提高能促進(jìn)木質(zhì)素及酚類等次生物質(zhì)的合成，是植物抵抗真菌病害的關(guān)鍵基因。本次實時熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2在接種霜霉菌12 h后苯丙氨酸解氨酶基因PAL表達(dá)量顯著高于易感品種‘黑比諾’與‘白玉霓’;Vannozzi通過基因組學(xué)分析認(rèn)為，芪類物質(zhì)是 葡萄抵御霜霉菌侵染的重要植保素之一，Gamm以多個釀酒葡萄為試材，利用實時熒光定量分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)多個抗病品種中的芪合酶基因STS在人工接種霜霉菌后會最先響應(yīng)霜霉菌的誘導(dǎo)，本次實時熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，丹鳳-2接種霜霉菌后芪合酶基因STS表達(dá)量顯著高于易感品種‘黑比諾’與‘白玉霓’;TLP家族是病程相關(guān)蛋白家族之一，在植物中具有廣譜的抗真菌活性。通過抑制真菌酶活性，使真菌細(xì)胞膜透化，從而起到抵抗真菌侵染的作用。Kortekamp分析多個抗病品種和易感品種中的PR蛋白編碼基因和苯丙類代謝相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，抗病基因在抗病品種和易感品種中的表達(dá)有顯著 差異，其中類甜蛋白基因TLP在抗病品種和易感品種中均有顯著表達(dá)。本試驗RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，類甜蛋白基因TLP在抗病株系丹鳳-2接種霜霉菌后12h表達(dá)量顯著提高;趙惠以3個抗病株系和3個感病株系為試材，利用實時熒光定量分析技術(shù)認(rèn)為，TLP、NPR1在6個不同株系中響應(yīng)霜霉菌侵染迅速，可能是葡萄調(diào)控霜霉病抗性的關(guān)鍵基 因，這與本次實時熒光定量分析結(jié)果不同，其原因可能與試材有關(guān)。綜上，中國野生葡萄、歐洲葡萄、歐美雜種葡萄對霜霉病表現(xiàn)出抗病性差異，其中中國野生葡萄商南-1、 湖南-1、商南-2、南鄭-1、白水-40、渭南-3、安林-2、 安林-3以及美洲品種‘瑞比爾’‘高妻’與砧木材料 ‘SO4’對霜霉病有較高的抗性，具有強(qiáng)的抗霜霉菌入侵以及抗病相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)能力。因此，中國野生葡萄抗霜霉病株系商南-1、湖南-1、商南-2、南鄭-1、白 水-40、渭南-3、安林-2與安林-3是今后抗病育種可以利用的親本材料與抗病種質(zhì)。
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