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芽變主要是芽分生組織細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，是自然界一種較為常見的現(xiàn)象，較多果樹品種是基于芽變選育出來的。其中，作為世界上最古老、最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的樹種之一的葡萄(VitisL.)，一些優(yōu)良栽培品種就源于芽變選育，如巨峰、玫瑰香、夏黑的一些芽變品種，已在生產(chǎn)中推廣、種植。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，人們?cè)趯?duì)芽變品種進(jìn)行利用的同時(shí)，深入研究了芽變的分子機(jī)制，以期了解芽變發(fā)生的規(guī)律。筆者在本文中將歸納引起葡萄芽變的原因及鑒定方法，分析芽變性狀變異機(jī)制，為今后的葡萄芽變育種等工作提供參考。

DNA序列的改變?cè)斐审w細(xì)胞突變，從而引起原有植株發(fā)生變異，進(jìn)而形成芽變。目前通過體細(xì)胞突變形成的芽變品種較多。體細(xì)胞突變通常發(fā)生在頂端分生組織的一些細(xì)胞中，導(dǎo)致嵌合體的發(fā)生。在葡萄中，頂端分生組織主要由兩個(gè)細(xì)胞層(L1、L2)組成。L1層主要調(diào)控表皮等其他外部組織，L2層參與內(nèi)部組織的調(diào)控。組織發(fā)生層理論顯示，突變時(shí)間不同導(dǎo)致不同嵌合體的形成。周緣嵌合體的形成主要是由于突變時(shí)間發(fā)生時(shí)間較早并且處于某個(gè)組織的中間位置;而扇形嵌合體的出現(xiàn)主要是由于突變較晚且不處于中間位置。

與其他果樹不同的是，葡萄芽變主要是在周緣嵌合體兩層細(xì)胞層間存在遺傳差異。體細(xì)胞突變一般會(huì)對(duì)植株的單一性狀造成改變，并不會(huì)引起整株植物的多個(gè)性狀發(fā)生改變，它們只改變單層細(xì)胞，致使出現(xiàn)周緣嵌合現(xiàn)象，但這種現(xiàn)象并不會(huì)改變整個(gè)植株的多個(gè)性狀，且在整個(gè)生長(zhǎng)期間都比較穩(wěn)定。此外，嵌合體中的細(xì)胞重新排列組合會(huì)引起整株植物基因型勻化。

周緣嵌合體可能會(huì)導(dǎo)致同一個(gè)基因座上出現(xiàn)兩個(gè)及兩個(gè)以上的等位基因。Franks等使用PinotMeunier及其芽變材料對(duì)體細(xì)胞突變進(jìn)行研究，將體細(xì)胞胚胎中的兩層細(xì)胞分離開，不同細(xì)胞層具有特異的DNA圖譜，表明了不同細(xì)胞層間存在遺傳差異。葡萄的嵌合機(jī)制不僅能修飾基因型，還能影響葡萄的改良。Hocquigny等研究發(fā)現(xiàn)，黑比諾(Pi-not)無性繁殖體產(chǎn)生遺傳多樣性的主要原因是第三個(gè)等位基因出現(xiàn)在本應(yīng)有兩個(gè)雜合位點(diǎn)的位置。對(duì)霞多麗芽變研究發(fā)現(xiàn)其表型變異不是由兩個(gè)不同的細(xì)胞層L1和L2之間相互作用引起的;通過SNV基因分型法證明Nebbiolo芽變的基因型不同于母本，芽變的基因型主要是由于L1層的改變。體細(xì)胞突變作為芽變產(chǎn)生的最主要原因，其L1層及L2層變異引起芽變的機(jī)制仍需深入研究。

二、葡萄芽變的鑒定

2.1形態(tài)學(xué)鑒定

芽變的遺傳類別改變主要由染色體結(jié)構(gòu)變異、基因突變、核外突變和染色體數(shù)目引起。芽變后葡萄植株多種性狀都會(huì)發(fā)生變異，如成熟期變異、果型變異、果實(shí)及顏色變異、果實(shí)無核變異。但通過比對(duì)親本及芽變的萌芽期、新梢顏色、葉片大小、果實(shí)顏色、果實(shí)成熟期、新梢節(jié)腹側(cè)間顏色等性狀可對(duì)芽變進(jìn)行迅速辨別。在目前發(fā)現(xiàn)的芽變品種中，變異的性狀可以分為成熟期變異、果型變異、果實(shí)及顏色變異、無核變異等。

形態(tài)學(xué)性狀的完善為芽變鑒定提供了可靠的依據(jù)，但表型的改變往往是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果。形態(tài)特征的改變易受外界條件的影響，會(huì)使鑒定結(jié)果出現(xiàn)偏差。

2.2孢粉學(xué)鑒定

植物花粉是由花器官發(fā)育而成的，具有高度的保守性和穩(wěn)定性。因此可以通過花粉形態(tài)、大小、花粉粒極軸長(zhǎng)/赤道軸長(zhǎng)等對(duì)花粉進(jìn)行鑒定。目前，在孢粉學(xué)的研究中主要突出孢粉的形態(tài)類型、孢粉的大小、孢粉的外壁紋飾，以及孢粉壁的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。李學(xué)強(qiáng)等對(duì)巨峰及其芽變98-2的孢粉進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其主要差異在花粉大小、形態(tài)及花粉粒極軸長(zhǎng)/赤道軸長(zhǎng)。但傳統(tǒng)的孢粉學(xué)鑒定僅通過花粉粒的形態(tài)特征而不關(guān)注花粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征，導(dǎo)致鑒定結(jié)果不夠全面。

2.3同工酶鑒定

同工酶是高等植物中普遍存在的蛋白質(zhì)分子，具有不同的結(jié)構(gòu)和相同的催化作用。其基于不同蛋白質(zhì)形成不同的蛋白質(zhì)區(qū)帶譜進(jìn)行鑒定。目前常用于同工酶鑒定的酶類主要有過氧化氫酶、酯酶以及過氧化物酶。李學(xué)強(qiáng)等使用POD同工酶對(duì)巨峰及其芽變98-2分析發(fā)現(xiàn)酶譜存在差異，表明巨峰及其芽變98-2間存在差異。由于每種同工酶代表基因數(shù)量有限，并不能全面反映遺傳差異，故可作為輔助鑒定方法。

2.4分子標(biāo)記鑒定

分子標(biāo)記(molecularmarker)主要應(yīng)用于植物性狀及基因型變異的檢測(cè)。芽變產(chǎn)生的本質(zhì)主要是遺傳物質(zhì)的變化，因此可以利用染色體和DNA分子水平的方式，來避免形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)和同工酶鑒定等方法的缺點(diǎn)，達(dá)到鑒定芽變的目的。DNA分子標(biāo)記是通過一定的方法或技術(shù)手段，在DNA分子水平上揭示個(gè)體或群體間DNA片段差異的一種遺傳標(biāo)記，在對(duì)芽變品種的鑒定中，已開發(fā)出多種DNA分子標(biāo)記并應(yīng)用于鑒定中。

王西平等對(duì)早熟芽變品種早生高墨及其親本高墨進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)引物OPG06及OPW02能有效區(qū)分開高墨及早生高墨，張國(guó)海應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記能有效鑒定出巨峰和京亞的芽變品種。然而在使用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)芽變品種進(jìn)行鑒定時(shí)，由于大部分引物標(biāo)記為顯性標(biāo)記，并不適用于對(duì)多數(shù)芽變品種進(jìn)行鑒定。

石艷艷利用iPBS(Inter-PrimerBindingSite)技術(shù)分別對(duì)峰早和巨峰、洛浦早生和京亞進(jìn)行區(qū)分鑒定，峰早和巨峰之間有12個(gè)iPBS引物均表現(xiàn)出不同的差異條帶，洛浦早生和京亞之間有9個(gè)iPBS引物表現(xiàn)出不同程度的差異性。李琳從50條ISSR(Inter-SimpleSequenceRepeat)引物篩選出29條ISSR引物及7對(duì)引物組合，同時(shí)使用引物BC825

能區(qū)分巨峰及其芽變品種峰早。Guo等利用SRAP(SequenceRelatedAmplifiedPolymorphism)分子標(biāo)記方法對(duì)鮮食品種中的3個(gè)芽變品種進(jìn)行鑒定。DNA分子標(biāo)記是區(qū)分芽變的一個(gè)重要手段，但是目前仍然沒有篩選出一些特定引物用來區(qū)分芽變品種。

三、葡萄芽變性狀變異機(jī)制

3.1果實(shí)顏色變異

果實(shí)顏色變異主要與花色苷和花青素的積累有關(guān)，同時(shí)果實(shí)顏色的變化也有助于人們對(duì)品種的區(qū)分。自從葡萄馴化以來，人們就用果實(shí)顏色的不同來區(qū)分品種。葡萄果實(shí)的顏色是由花色苷在果皮和果肉中的積累引起的。而花色苷是由苯丙烷合成途徑和類黃酮生物合成途徑完成的。Carrier等通過對(duì)黑比諾及其3個(gè)克隆體的全基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，平均每Mb分別有1.6個(gè)和5.1個(gè)SNP缺失。Vezzulli等對(duì)黑比諾的5個(gè)核心SNP位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明這5個(gè)SNP區(qū)域具有一種特異性的遺傳結(jié)構(gòu)，在黑比諾、灰比諾、白比諾中總有一個(gè)等位基因的表達(dá)量偏低。

Kobayashi等對(duì)白皮及紅皮葡萄研究發(fā)現(xiàn)，UFGT基因調(diào)控白皮和紅皮葡萄果實(shí)中花青素的合成，紅皮葡萄中的UFGT基因表達(dá)量高于白皮葡萄果實(shí)，但其編碼序列和啟動(dòng)子無任何差別，表明葡萄果皮由白變紅主要是調(diào)控UFGT基因的上下游基因突變引起的。同時(shí)結(jié)果表明VvmybA1作為主要的調(diào)控基因，在類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶UFGT基因的表達(dá)中起著重要作用，并影響花青素的合成。研究表明白色葡萄品種的出現(xiàn)主要是由于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Gret1插入到VvmybA1基因的啟動(dòng)子區(qū)域中;而紅色突變主要是由于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Gret1未插入到VvmybA1基因中。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Gret1是否插入到VvmybA1基因是調(diào)控果皮顏色的關(guān)鍵，其主要是通過抑制花青素生物合成基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生葡萄果色芽變。

在人們開始關(guān)注葡萄顏色變異時(shí)，主要研究變異中花青素含量的變化，目前更多的學(xué)者開始關(guān)注基因是如何參與到花青素的生物合成中，并對(duì)調(diào)控通路、遺傳機(jī)制及分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。

3.2葡萄花序和果穗變異

葡萄果穗主要由葡萄果粒組成，花序及果實(shí)的大小、坐果率的高低影響果穗的形狀和大小。在種植和生產(chǎn)上，釀酒葡萄的果穗小且緊湊，鮮食葡萄的果穗大且稀疏。這主要是由于在葡萄的馴化和篩選過程中，基因的表達(dá)模式及表達(dá)量不同從而導(dǎo)致葡萄花序及果穗變異的產(chǎn)生。

在對(duì)果穗變異及其親本研究中發(fā)現(xiàn)，赤霉素的負(fù)調(diào)節(jié)基因VvGAI1參與調(diào)控果穗的大小，同時(shí)對(duì)VvGAI1基因進(jìn)行序列多態(tài)性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)單個(gè)基因?qū)ζ咸阉胭|(zhì)量、出汁率、風(fēng)味等性狀影響較小。Hall等等研究發(fā)現(xiàn)，花序軸韌皮部的壞死導(dǎo)致漿果中水分和糖分不再積累，但花序軸韌皮部的壞死并不影響種子在果實(shí)中的發(fā)育。Chatelet等通過對(duì)體細(xì)胞突變進(jìn)行誘導(dǎo)，得到了4種不同于親本的花序表型，發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞突變導(dǎo)致擬南芥成花基因AG、SEP和AGL13的同源因子VvMADS-box1、2和3在花發(fā)育過程中表達(dá)模式發(fā)生了轉(zhuǎn)化，而VvMADS-box基因的表達(dá)模式與相應(yīng)的親本相似。

葡萄花序發(fā)育早期出現(xiàn)的表型變化主要跟葡萄重復(fù)分生組織(RRM)相關(guān)，變異品種花序發(fā)育期延長(zhǎng)，導(dǎo)致開花延遲，從而影響果穗的發(fā)育和果實(shí)的成熟。佳麗釀(Carignan)RRM表現(xiàn)型的出現(xiàn)主要與VvTFL1A基因表達(dá)量的增高密切相關(guān)，歸其原因主要是VvTFL1A基因中的一個(gè)二級(jí)轉(zhuǎn)座子插入。Fernandez等通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)及分子生物學(xué)的方法研究發(fā)現(xiàn)，將二級(jí)轉(zhuǎn)座子Hatvine1-rrm插入到VvT-FL1A基因的啟動(dòng)子，可以上調(diào)莖尖營(yíng)養(yǎng)及生殖器官的VvTFL1A等位基因的表達(dá)。

3.3成熟期變異

果實(shí)成熟是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到許多高度協(xié)調(diào)的生理和生化變化，進(jìn)而影響果實(shí)的外觀。果實(shí)成熟包括果皮顏色的一系列變化，可溶性糖的積累、酸的減少、香氣化合物的增加。果實(shí)糖、酸的變化主要是一些調(diào)控基因的表達(dá)所引起的。目前對(duì)與成熟期相關(guān)的芽變品種和原有品種差異表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明大多數(shù)差異基因與果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的生物合成途徑有關(guān)。植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在果實(shí)成熟過程中有著至關(guān)重要的作用。特別是ETH和ABA在調(diào)節(jié)果實(shí)發(fā)育中起到?jīng)Q定性作用。植物激素ETH和ABA促進(jìn)果實(shí)的成熟，而IAA抑制果實(shí)的成熟和著色。

巨峰的芽變品種峰早較巨峰提前成熟30d，郭大龍等根據(jù)E-L系統(tǒng)對(duì)巨峰及峰早漿果不同發(fā)育時(shí)期的生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，研究表明峰早中的花色素含量及果實(shí)軟化相關(guān)的半乳糖醛酸酶活性增長(zhǎng)速率均明顯高于巨峰并參與到果實(shí)成熟過程中;同時(shí)，Xi等研究巨峰及峰早成熟過程中代謝相關(guān)酶和活性氧(ROS)的變化，結(jié)果表明峰早果實(shí)中的活性氧水平總高于巨峰，活性氧參與并促進(jìn)果實(shí)的成熟。石艷艷通過MSAP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)甲基化率進(jìn)行分析，結(jié)果表明芽變的甲基化率低于親本，果實(shí)提早成熟主要是某些基因發(fā)生了脫甲基化。Guo等對(duì)巨峰及峰早果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)基因表達(dá)量差異較為顯著，其中與活性氧相關(guān)基因VIT_214s0030g00950的表達(dá)量主要在巨峰中表達(dá)較高，但在始熟期時(shí)低于峰早。Xu等在對(duì)夏黑及其早熟芽變分析中發(fā)現(xiàn)夏黑中SNP位點(diǎn)突變主要集中在其18號(hào)染色體，在其芽變中SNP位點(diǎn)突變主要集中在其17號(hào)染色體。

3.4果型變異

果樹中花授粉受精后果實(shí)開始生長(zhǎng)，這是一種較為特別的特化結(jié)構(gòu)。果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育過程可分為兩個(gè)階段，即細(xì)胞分裂期與細(xì)胞膨大期。在果實(shí)發(fā)育階段，成熟后果實(shí)的形狀與大小主要根據(jù)細(xì)胞的數(shù)目與大小所決定。目前在對(duì)葡萄的研究中，果型主要依靠雜交后代與實(shí)生后代進(jìn)行選育并研究，但一些葡萄品種中果型發(fā)生了變異。

利用無核白芽變選育出了長(zhǎng)粒無核白、大粒無核白等芽變品種，通過對(duì)無核白及其芽變對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)芽變品種中白藜蘆醇含量較高，而總酚含量較低。瘦肉果突變(flb)最早于1996年在白玉霓(Un-giBlanc)中發(fā)現(xiàn)，后來被鑒定為遺傳性嵌合體，在對(duì)葡萄果實(shí)發(fā)育及大小研究中，為一種優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)材料。其主要是由于親本植株在花期前子房開始皺縮，發(fā)育出特殊的中果皮，致使產(chǎn)生的后代坐果異常，產(chǎn)生瘦肉果突變。

瘦肉果突變?yōu)楣庑螒B(tài)的分子調(diào)控機(jī)制提供了有利的基因型。通過親本與瘦肉果突變體果實(shí)成熟期對(duì)比發(fā)現(xiàn)，與親本相比，瘦肉果突變中液泡較多，細(xì)胞特異性受損導(dǎo)致中果皮發(fā)育不全。同時(shí)在瘦肉果突變及親本的基因組中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子VvMADS9表達(dá)量較高，而在親本中并不表達(dá)，因此漿果形態(tài)的變異可能與轉(zhuǎn)錄因子VvMADS9的表達(dá)相關(guān)。

3.5無核變異

無核是鮮食葡萄最有價(jià)值的品質(zhì)特征之一，世界上對(duì)無核葡萄品種的需求也不斷增長(zhǎng)。目前已有一些品種發(fā)生了從有核到無核的突變，如Emper-or、GoHaskellsNo.45、Chasselas、Concord、Catawba、Mustat、Hamburg、Tokay、RedMuscadel和Liatiko等。無核突變體與親本相比果實(shí)質(zhì)量下降，對(duì)親本及無核芽變測(cè)序發(fā)現(xiàn)一些差異基因主要富集在花粉和胚珠發(fā)育途徑，在基因組上存在一些SNP位點(diǎn)的變異及Indel。在對(duì)差異基因分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，B3轉(zhuǎn)錄因子基因家族在生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮著特定的作用，一些基因在無核突變體及其親本中差異表達(dá)。同時(shí)在VvAGL11基因區(qū)域鑒定出多個(gè)SNP位點(diǎn)變異，對(duì)VvAGL11進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在種子發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期，無核突變體中VvAGL11基因未表達(dá)，表明VvAGL11基因?yàn)闊o核主要的候選基因。

3.6植株結(jié)構(gòu)變異

在極少數(shù)情況下，芽變可以改變植株的表型結(jié)構(gòu)。PinotMeunier是黑比諾的芽變品種，其特點(diǎn)是葉子和莖上密布著毛狀體，卷須轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄐ?。有時(shí)在PinotMeunier上會(huì)出現(xiàn)缺乏毛狀表型的葉扇區(qū)，這表明它是具有突變體L1的周緣嵌合體。事實(shí)上，從L1或L2層再生的植株表明L1衍生的植株是有毛的，而L2衍生的植株是無毛的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)L1層的變異植株節(jié)間較短，具有矮化作用。利用赤霉素(GA)對(duì)矮化植株進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)其并不是赤霉素(GA)生物合成突變體。該突變是由VvGAI高度保守的DELLA域中的非同義SNP引起的，該域編碼GA關(guān)鍵響應(yīng)蛋白的成員。

3.7倍性變異

葡萄二倍體自然突變?yōu)槎啾扼w途徑主要有體細(xì)胞融合、體細(xì)胞加倍和配子加倍三種。目前突變?yōu)槿扼w的較少，主要的突變類型為二倍體突變?yōu)樗谋扼w。選擇四倍體的優(yōu)良芽變是改良葡萄品種的重要途徑之一。異常的環(huán)境更易誘導(dǎo)突變，自然突變是自然發(fā)生的，不受人為控制。通過自然芽變篩選培育葡萄多倍體新品種，速度緩慢，隨機(jī)性大。

四、展望

芽變選育因簡(jiǎn)便、實(shí)用性等優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，一直是果樹品種選育的重要途徑。芽變品種在提供新的表型的同時(shí)，還保留了原有親本的理想性狀，這也是很多栽培品種源自于芽變的原因。目前果樹上存在很多的芽變品種，而葡萄通過芽變選育的品種多達(dá)50個(gè)。但是目前依然通過形態(tài)學(xué)及多種DNA分子標(biāo)記法對(duì)芽變進(jìn)行鑒定。是否有一些特定的引物對(duì)芽變品種進(jìn)行區(qū)分鑒定，目前尚未可知。隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，相信這一問題可以得到很好地解決。目前存在著多種多樣的芽變品種，不同的基因參與到不同的調(diào)控中。通過對(duì)葡萄芽變及其親本的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些基因在芽變表型的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，如ERF相關(guān)基因可能引起夏黑早熟芽變的成熟期提前、VvAGL11基因?yàn)槠咸褵o核突變體關(guān)鍵候選基因。但這些基因在芽變中的作用機(jī)制仍不明確。

未來隨著技術(shù)的發(fā)展，對(duì)芽變的機(jī)制研究方向主要是：(1)如何區(qū)分芽變及其親本；(2)對(duì)芽變及其親本甲基化、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)(SV)等的研究;(3)具體性狀的芽變機(jī)制;(4)如何將研究結(jié)果運(yùn)用到育種上，定向培育出優(yōu)良的芽變品種。